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视黄酸受体表达对脐血淋巴细胞功能的影响
研究生 吴冰冰 导师 王卫平 杨 毅
（复旦大学附属儿科医院 200032）
维生素A是维持人体健康的必需微量营养素，对机体的免疫系统有着重要的促进作用。已有的研究表明，视黄酸（retionic
acid，RA）――维生素A的主要活性代谢产物能上调脐血淋巴细胞（Cord Blood Lymphocytes，
CBLs）视黄酸受体RARa基因表达水平，同时RARa表达水平同CBLs IgM的产量及相应细胞因子的基因转录水平呈正相关，但是目前尚没有充分的证据证明两者之间存在必然的联系。因此本文选用RARa选择性拮抗剂Ro
41－5253进行阻抑实验，以进一步明确视黄酸受体RARa表达在RA促进CBLs功能中的作用。
材料与方法
1、 淋巴细胞体外培养
脐血标本共20例， 获自上海市国际和平妇幼保健院及复旦大学附属妇产科医院母婴健康足月产儿，Ficoll分离单个核细胞后，用含10％小牛血清、青霉素、链霉素的RPMI1640培养液（GIBCO产品）悬浮细胞为106个/ml，培养在96孔U型板中，加入丝裂原SAC或PHA，终浓度分别为SAC
1：1800（v/v），PHA 5?g/ml， RA 1×10－6mol/L，Ro 41－5253
1×10－5mol/L。在培养24h后收获细胞，测定RARa、IL－4、IL－6和IFN－?的转录水平。培养5d后收集细胞上清液进行IgM含量测定。
2、总RNA提取和RT－荧光定量PCR法检测RARa和细胞因子转录水平
培养的CBLs采用TRIzol试剂提取制备总RNA，测定OD260对RNA进行准确定量。取2ug总RNA，经MMLV逆转录酶催化合成cDNA第一链，以此为模板进行荧光定量PCR扩增，荧光介质选用SYBR
Green I，根据同时扩增的标准曲线，计算出各样本的初始拷贝数。
引物设计：参考国内外文献资料并采用计算机辅助设计（表1）。
3、细胞上清液中IgM含量的测定
采用ELISA双抗体夹心法检测上清液中的IgM含量
4、数据统计与显著性检验
所有数据以均数±标准差表示，RARa和细胞因子基因转录水平的数据先取对数后再分析。以?-actin
作为RT－荧光定量PCR的质控。当P<0.05时认为有统计学意义。
结 果
一、受体激活剂RA和拮抗剂Ro 41－5253对丝裂原活化的CBLs RARa基因转录水平的影响
1、RA、Ro对SAC活化的CBLs RARa基因转录水平的影响
单用SAC刺激后RARa 基因转录水平较未加任何刺激物的空白对照有所升高，两者差别有统计学意义（P<0.05）。当加入生理浓度的RA与SAC共同培养后，RARa
基因的转录水平高于单用SAC刺激组，RA对SAC活化CBLs RARa受体转录水平的上调作用能被Ro所抑制（表1）。
2、 RA、Ro对PHA活化的CBLs RARa基因转录水平的影响
CBLs在PHA刺激的同时加入生理浓度的RA后，RARa基因转录水平即呈现上调，在24h达到高峰，与单用PHA组相比两者差异有统计学意义（P<0.05）。在加入拮抗剂Ro之后，RA对RARa基因表达的上调作用受到抑制，两者差异有统计学意义（P<0.05）（表3）。
二、RA、Ro对体外培养CBLs IgM生成能力的影响
CBLs在SAC刺激的同时加入生理浓度的RA后IgM的产量由（1248.72±621.15）ng/ml增至（3022.98±1077.81）ng/ml，较单用SAC刺激组增高约2.42倍，两者差异有统计学意义（P<0.01），而加入拮抗剂Ro后IgM产量明显下降（1237.72±529.84）ng/ml，RA对CBLs
IgM生成能力的促进作用受到抑制（P<0.01）（图1）。
三、RA、Ro对丝裂原活化的CBLs细胞因子基因转录水平的影响
1、RA、Ro对SAC活化的CBLs IL－4基因转录水平的影响
SAC刺激的CBLs在加入生理浓度的RA后，细胞因子IL－4 的基因转录水平即呈现上调，并在24h达到高峰，与RARa基因表达水平的峰值时间一致，与单用SAC刺激组相比两者差异有统计学意义（P<0.05）。在加入拮抗剂Ro
41－5253后，RA对IL－4基因转录水平的上调作用受到抑制，两者差异有统计学意义（P<0.05）（表4）。
2、RA、Ro对SAC活化的CBLsIL－6基因转录水平的影响
CBLs在SAC刺激的同时加入生理浓度的RA，其IL－6基因转录水平在24h高于单用SAC刺激组，两者差异有显著性（P<0.05）。拮抗剂Ro
41－5253能抑制RA对SAC活化CBLsIL－6基因转录的上调作用，两者差异有统计学意义（P<0.05）（表5）。
3、RA、Ro对PHA活化的CBLsIFN－?基因转录水平的影响
PHA刺激的CBLs在加入RA后，细胞因子IFN－? 的基因转录水平呈现上调，同单用PHA组相比，两者差异均有统计学意义（P<0.05）。在加入受体拮抗剂Ro后，RA对IFN－?基因转录水平的上调作用受到抑制，同PHA+RA组相比两者差异有统计学意义（P<0.05）（表6）。
4、RA、Ro对PHA活化的CBLs IL－4基因转录水平的影响
PHA刺激的CBLs在加入生理浓度的RA以及拮抗剂Ro后，各组间细胞因子IL－4 的基因转录水平差异无统计学意义。
5、RA、Ro对PHA活化的CBLs IL－6基因转录水平的影响
PHA刺激的CBLs在加入生理浓度的RA后，细胞因子IL－6 的基因转录水平高于单用PHA刺激组，两者差异有统计学意义。在加入拮抗剂Ro
41－5253后，RA对IL－6基因转录水平的上调作用受到抑制（P<0.05）（表7）。
讨 论
视黄酸（RA）——是VA的主要活性代谢产物，它通过与两类核受体RARs及RXRs 结合来完成多种生理功能。RARs及RXRs均属于类固醇/甲状腺激素核内受体超家族成员，它们在核内作为配体依赖的转活化因子来调控特异性目的基因的表达[1、2]。我们在以往对RAR家族三个亚型的研究中发现，人外周血淋巴细胞主要表达RARa受体，且该受体基因的转录水平受到丝裂原和RA的调节[3]。
本次研究中我们再次观察到人CBLs在静息状态及被丝裂原活化状态都表达RARa受体，当在丝裂原活化的CBLs中加入生理浓度的RA时，则RARa基因转录水平显著高于单用丝裂原活化组。这与我们以往的研究结果以及Friedmam[4]的报道相一致。有研究显示RARa基因调控区存在视黄酸反应元件[5、6]，因此RARa受体基因也是直接受到RA调控的基因之一。我们在实验中观察到RA能上调RARa基因转录水平，表明RARa具有配体诱导的转录增强的功能，这可能在后续进一步促进和扩大RA的效应中起到重要的作用。RA对RARa受体基因表达水平的上调作用在加入拮抗剂Ro
41－5253后即受到抑制。作为视黄酸受体家族的主要成员，RARa受体基因在CBLs表达，并且其转录水平受到丝裂原和受体激活剂以及拮抗剂的调控，提示我们该受体途径可能在RA促进CBLs免疫功能中起到关键的作用。
本次实验中经SAC活化的CBLs在加入RA后，我们首先在24h观察到RARa基因表达水平的明显上调，随后在培养第五天通过ELISA双抗体夹心法检测到SAC＋RA组免疫球蛋白IgM的产量显著高于单用SAC刺激组。当加入拮抗剂Ro之后，RA对经SAC活化的CBLs
RARa基因转录水平的上调作用受到抑制。且随着RARa基因表达水平被Ro所阻抑，CBLs IgM的产量也明显降低。这一结果表明RARa基因表达在RA促进CBLsIgM生成的过程中起到了一个关键性作用。
我们在进一步对细胞因子基因转录水平的检测中发现，RA能使丝裂原活化CBLsIL－4、IL－6和IFN－?基因转录水平上调，这一作用能被拮抗剂Ro所抑制。表明RARa基因表达参与了对细胞因子IL－4，IL－6、IFN－?转录水平的调控。
IL－4是重要的Ⅱ型细胞因子，它可以促进B细胞的生长和分化，对B细胞抗体的生成和类别的转换有着重要的作用[7]。IL－6主要作用于活化B细胞的终末分化阶段，能促使B细胞最后分化为抗体分泌细胞[8]。因此，这两种细胞因子对B细胞抗体的生成均有促进作用。提示我们RA可能通过RARa对细胞因子基因表达水平进行调节来促进CBLsIgM的生成。
IFN－?是一种很强的单核－巨噬细胞活化剂，它能促进MHCⅠ类分子的表达，又可促进多种细胞表达MHCⅡ类分子，对体液免疫和细胞免疫均有增强作用。此外，作为主要的Ⅰ型细胞因子，IFN－?还能促进静止的CD4＋T细胞分化为Th1细胞。我们在研究中观察到RA可以上调CBLsIFN－?基因转录水平，表明RA对新生儿期Th1细胞的发育也有一定的促进作用。目前，国内外许多研究显示维生素A缺乏会使Th2介导的体液免疫受损，而经补充维生素A后能增加Ⅱ型细胞因子的生成，促进抗原特异性Th2细胞的分化。但是也有研究报道维生素A缺乏时Th1介导的细胞免疫也会受到影响，有学者在对小鼠的研究中发现在维生素A缺乏时Th1介导的DTH反应能力下降，维生素A缺乏的鸡在新城疫病毒的感染下细胞毒T细胞的应答也受损[9]。Rahman在对小于6个月婴儿的研究中发现，高剂量补充维生素A后血清水平正常的婴儿（>0.7?mol/L）DTH反应阳性率较对照组增加[10]。此外，Allende[11]等学者也观察到维生素A能促进抗CD3诱导的正常人外周血淋巴细胞IFN－?和IL－2的生成。以上结果表明维生素A在某些情况下对于Th1应答也有重要的促进作用。
新生儿期是个体生长发育特殊的时期，此时免疫系统还处于发育阶段，各方面功能有待于进一步完善，正常孕期激素分泌的影响，辅助细胞数量、功能的降低以及细胞因子IL－12、IFN－?分泌不足，使此期免疫应答以Th2型占优势[12]。而新生儿期感染性疾病的发病率和死亡率较高，这一增高的易感性正同该时期免疫系统的不成熟和免疫应答偏向于不能较好清除胞内病原体的Th2型有关。
我们此次的研究结果显示，RA能上调PHA活化CBLsIFN－?的基因转录，表明其对CBLs Th1细胞的发育也有一定的促进作用。Th1/Th2的正常比值是维持机体正常免疫功能重要因素，RA能促进CBLsTh1的发育，这在新生儿期抗感染免疫中将有着深远的意义。
通过拮抗剂阻抑实验我们可以得到以下结论：1、RARa受体基因在CBLs表达，并且其转录水平受到丝裂原、受体激活剂以及拮抗剂的调节。2、RA促进SAC活化的CBLs
IgM生成的作用是通过RARa受体途径来介导的。3、RARa受体参与调节细胞因子IFN－?、IL－4、IL－6在CBLs中的表达。4、RARa受体表达调节是RA促进CBLs功能的重要途径。
关键词： 视黄酸受体－a 脐血淋巴细胞 白细胞介素4
白细胞介素6 干扰素－? IgM合成
参考文献
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receptor status in mouse spleen during a primary immune
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2、 Beard RL, Duong TT, Teng M, et al. Synthesis and
biological activity of retinoic acid receptor-a spcific
amides. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,2002,12:3145-3148
3、 王卫平、杨毅、苏贻新. 人外周血淋巴细胞视黄酸受体基因的表达与调控. 营养学报,1998,20:275
4、 Friedman A, Halevy O, Schrift M, et al. Retinoic
acid promotes proliferation and induces expression
of retinoic acid receptor-a gene in murine T lymphocytes.
Cellular Immunology,1993,152:240-248
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acid receptor a2 isoform is transcribed from a promoter
that contains a retinoic acid response element. Proc
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7、 龚非力. 基础免疫学. 武汉：湖北科学技术出版社,1998:132
8、 Jones S, Horiuchi S, Topley N, et al. The soluble
interleukin 6 receptor: mechanisms of production and
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9、 Ross AC, Stephensen CB. Vitamin A and retinoids
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of early vitamin A supplementation on cell-mediated
immunity in infants younger than 6 mo. Am J Clin Nutr,1997,65:144-148
11、 Allende LM, Corell A, Madrono A, et al. Retinol(Vitamin
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12、 Morein B, Abusugra I, Blomqvist G. Immunity in
neonates. Veterinary Immunology and Immunophthology,2002,87:207-213
表1. RARa和各细胞因子引物序列
检测基因 上下游引物序列 5’－3’ 产物长度（bp）
RARa CTGTGAGAAACGACCGAAAC 211
TTGTCCCCAGAGGTCAATGTC
IL-4 GCGATATCACCTTACAGGAG 308
TTGGCTTCCTTCACAGGACA
IL-6 AAATTCGGTACATCCTCGAC 295
CAGGAACTGGATCAGGACTT
IFN－? TGCAGGTCATTCAGATCTAG 306
AGCCATCACTTGGATGAGTT
?-actin CTGTGAGAAACGACCGAAAC 122
CTGTGAGAAACGACCGAAAC
表2. SAC活化CBLs 在RA、Ro作用下RARa基因拷贝数对数值(?X ? S )
分组 24h
SAC 6.96?1.15 #
SAC+RA 7.14±1.12 *
SAC+RA+Ro 6.80±1.22
Control 6.69±1.21
*－SAC+RA组与单用SAC及SAC+RA+Ro组相比差异均有统计学意义 P<0.05
＃－SAC组与Control组相比两者差异有统计学意义 P<0.05
表3. PHA活化CBLs在RA、Ro作用下RARa基因拷贝数对数值(?X ? S )
分组 24h
PHA 6.83±1.08
PHA+RA 7.09±1.14 *
PHA+RA+Ro 6.94±1.06
Control 6.59±1.22
*－PHA+RA组与单用PHA及PHA+RA+Ro组相比差异均有统计学意义 P<0.05
图1. CBLs IgM产量在RA、Ro作用下的变化
**－SAC+RA组与单用SAC及SAC+RA+Ro组相比差异均有统计学意义 P<0.01
表4. SAC活化CBLs在RA、Ro作用下IL－4基因拷贝数对数值(?X ? S )
分组 24h
SAC 5.51±1.29
SAC+RA 5.78±1.31 *
SAC+RA+Ro 5.33±1.32
*－SAC+RA组与单用SAC及SAC+RA+Ro组相比差异均有统计学意义 P<0.05
表5. SAC活化CBLs在RA、Ro作用下IL－6基因拷贝数对数值(?X ? S )
分组 24h
SAC 9.12?0.96
SAC+RA 9.36?0.90 *
SAC+RA+Ro 9.06?0.78
*－SAC+RA组与单用SAC及SAC+RA+Ro组相比差异均有统计学意义 P<0.05
表6. PHA活化CBLs在RA、Ro作用下IFN-?基因拷贝数对数值(?X ? S )
分组 24h
PHA 7.37±0.61
PHA+RA 7.79±0.65 *
PHA+RA+Ro 7.39±0.89
*－PHA+RA组与单用PHA及PHA+RA+Ro组相比差异均有统计学意义 P<0.05
表7. PHA活化CBLs在RA、Ro作用下IL－6基因拷贝数对数值(?X ? S )
24h
PHA 8.77±0.54
PHA+RA 8.93±0.55 *
PHA+RA+Ro 8.73±0.60
*－PHA+RA组与单用PHA及PHA+RA+Ro组相比差异均有统计学意义 P<0.05
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